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淋巴细胞的分离和计数方法

2018-01-04 16:51  来源:医学教育网    打印 | 收藏 |
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淋巴细胞分离是免疫检验的重要考点,各位考生应该熟练掌握,为此,医学教育网整理了与淋巴细胞分离的相关知识,希望对各位考生有所帮助。 原理: 外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。 实验设备: 移液管、1ml移液器、刻度吸管、5ml注射器、EP管、显微镜、离心机。 实验材料: 肝素、淋巴细胞分离液、RPMI1640粉末、稀释液(生理盐水)。 操作流程: 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中,(每1ml全血加0.1ml125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝。 3.稀释(外周血:稀释液=1:2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀)。 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁,把稀释血缓慢叠加于分层液面上,医学/教育网注意保持清楚的界面(Ficoll:稀释血=1:2)。 5.放入离心机1500r/min离心20min(注:缓慢加速1-4档个3分钟)。 6.用吸管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上体积的稀释液(生理盐水),1500rpm×10分钟离心,洗涤细胞。 7.重复洗涤一次,1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞。 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度。 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞。 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果。 3.在Ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面。 4.Ficoll应适量,外周血应充分稀释。 5.吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。 淋巴细胞计数: 实验流程: 1.准备计数板。 2.制备细胞悬液:收集细胞,制成单个细胞悬液。 3.加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。 4.计数:在显微镜下,用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。 5.计算:将结果代入下式,得出细胞密度。 胞数/毫升原=(4大格细胞数之和/4)×104 以上就是医学教育网整理的于淋巴细胞分离的知识点,如果想了解更多相关内容请前往医学教育网进行查看。
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